کروماتوگرافی گازی و هر آن چه که باید درباره آن بدانید

پردیس فناوری کیش_طرح مشاوره متخصصین صنعت و مدیریت_گروه مهندسی شیمی

کروماتوگرافی گازی و هر آن چه که باید درباره آن بدانید

مقدمه

کروماتوگرافی گازی (Gas Chromatography, GC) برای جداسازی و آنالیز ترکیبات فرار به کار می رود. اجزای یک نمونه تبخیر شده، با تقسیم بین یک فاز متحرک گازی و فاز ساکن جداسازی می شوند. نمونه های جامد یا مایع ابتدا باید به بخار یا گاز تبدیل شوند و سپس با کروماتوگرافی گازی اجزاء آن را جداسازی و شناسایی کرد. شرط جداسازی در این روش آنست که نمونه مورد نظر با حرارت دادن و تبدیل شدن به گاز تجزیه نشود. کروماتوگرافی گازی یک تکنیک قوی ست که امکان جداسازی ترکیبات بسیار پیچیده را در حداقل زمان ممکن فراهم می کند.

کروماتوگرافی گازی به دو دسته گاز-مایع (gas-liquid chromatography, GLC) و گاز-جامد ( gas-solid chromatography, GSC) تقسیم می شود. اساس روش GLC، که کاربرد بسیار گسترده تری دارد، تقسيم آناليت بين فاز متحرك گازی و يك فاز مايع تثبيت شده بر سطح يك جامد بی اثر است. روش GSC بر پايه فاز ساكن جامدی بنا شده است كه در آن بازداری آناليت ها نتيجه جذب سطحی فیزیکی است. به علت بازداری نیمه دائمی ترکیبات فعال یا قطبی که سبب دنباله دار شدن پیک ها می شود، روش GSC کاربرد محدودی دارد.

برخلاف بیشتر روش های کروماتوگرافی فاز متحرک برهم کنشی با مولکول های آنالیت نداشته و فقط نقش انتقال آنالیت در ستون را به عهده دارد. از این رو به فاز متحرک در GC گاز حامل (Carrier gas) نیز می گویند. هر مولکولی که برهم کنش بیشتری با فاز ساکن داشته باشد و بیشتر جذب ستون شود، دیرتر از ستون خارج می شود. با توجه به اهمیت فشار و دما در کروماتوگرافی گازی اغلب از حجم بازداری به جای زمان بازداری استفاده می شود.

آشنایی با دستگاه کروماتوگرافی

اولین دستگاه کروماتوگرافی گازی از نوع گاز-مایع در سال 1955 وارد بازار شد و از آن پس بالغ بر صد مدل مختلف توسط شرکت های مختلف ارائه شده است که بر حسب امکانات و لوازم جانبی دستگاه، قیمت های متنوعی دارند. شمای کلی دستگاه های GC در شکل بالا نشان داده شده است. قسمت های اصلی دستگاه های GC عبارتند از:

مخزن گاز حامل

فاز متحرک یا گاز حامل تنها وظیفه انتقال نمونه از ستون را به عهده دارد. به طور کلی گاز حامل باید نسبت به نمونه و حلال بی اثر باشند، خلوص بالایی داشته و در دسترس باشد، ارزان بوده و مناسب آشکارساز مورد استفاده باشد.

هلیوم، آرگون، نيتروژن و هيدروژن به عنوان گاز حامل به کار برده می شوند. گاز حامل باید خالص، بدون رطوبت و عاری از اکسیژن باشد. خلوص گاز حامل مهم ترین ویژگی آن است زیرا وجود ناخالصی در گاز حامل سبب ایجاد نویز (noise) شده و بر حساسیت تاثیر می گذارد و در نتیجه دقت کمی آنالیز را کاهش می دهد.

حضور ترکیباتی مانند آب و اکسیژن سبب مشکلاتی در آنالیز خواهد شد. حضور اکسیژن باعث اکسداسیون و تغییر حجم بازداری شده و در نتیجه تفکیک پذیری را کاهش می دهد و اگر فاز ساکن قطبی باشد به فاز ساکن صدمه وارد کند. آب به دلیل هیدروژناسیون می تواند هم به فاز ساکن و هم نمونه آسیب برساند.

نوع گاز حامل تاثیر زیادی در کارایی ستون و زمان آنالیز دارد. گاز حامل سبکی مانند هیدروژن با سرعت زیادی که دارد باعث کاهش کارایی ستون می شود و زمان آنالیز را کاهش می دهد، در عوض گاز حامل نیتروژن که سنگین تر است سبب افزایش کارایی ستون شده ولی زمان آنالیز را افزایش می دهد. در واقع در حجم بهينه و مناسب، نیتروژن بالاترین کارایی را دارد. گاز هليم خطری ندارد و از راندمان آن در سرعت های بالا نیز كاسته نمی شود. هیدروژن به علت قابلیت انفجار و مشکلات نگهداری آن کمتر مورد توجه است.

اگرچه هلیوم گاز متداولی برای GC است ولی استفاده از آن به علت گران بودن قیمت، با محدودیت همراه است. در حجم بهينه و مناسب، نیتروژن بالاترین کارایی را دارد ولی در سرعت بالا از کارایی آن کاسته می شود. بنابراین برای آنالیز معمول، غالبا نیتروژن به عنوان گاز حامل به کار می رود.

گازی که به دستگاه و در نتیجه به ستون وارد می شود باید فشار و سرعت جریان مشخص و ثابتی داشته باشد. برای این منظور لوازم جانبی مانند کنترل کننده جریان، رگلاتور های فشار، روتامتر و غیره برای تنظیم و کنترل فشار و سرعت جریان گاز حامل استفاده می شود. روتامتر یک وسیله برای اندازه گیری دبی مایعات و گازها ست. فشار ورودی در دستگاه GC 10-50 psiبالاتر از فشار اتاق است. سرعت جریان گاز حامل برای برای ستون های پرشده 25-150  میلی لیتر بر دقیقه و برای ستون های مویین 0.1-25 میلی لیتر بر دقیقه است.  میزان سرعت جریان گاز حامل به قطر ستون و  نوع گاز بستگی دارد.

سيستم تزريق نمونه

نمونه های مورد آنالیز توسط سیستم تزریق نمونه یا انژکتور (Injector) به ستون وارد می شوند. نمونه پس از ورود به injector به بخار تبديل شده، با فاز متحرك مخلوط شده و سپس برای جداسازی وارد ستون مي شود. برای دست یابی به کارایی بالای ستون، نمونه باید در اندازه مناسب و به صورت توده ای (plug) از بخار، وارد ستون شود. تزرق آرام و اندازه نامناسب نمونه باعث پخش شدن آن در ستون و جداسازی ضعیف می شود.

تزریق می تواند به صورت دستی با سرنگ های مخصوص انجام شود یا به صورت اتوماتیک. تمامی دستگاه های مدرن امروزی دارای سیستم تزریق اتوماتیک نمونه (auto sampler) هستند. ستون های مویی گنجایش خیلی کمی برای نمونه دارند و تزریق بیش از ظرفیت ستون سبب سرریز شدن (over loading) می شود بنابراین روش های تزریق مختلفی دارند.

تزریق نمونه های گازی بیشتر از طریق شیر (valve) با نام اختصاصی (gas sampling valve, GSV) انجام می شود. این شیرها معمولا یک حلقه نمونه (sample loop) دارند که به نسبت حجمی که باید تزریق گردد، می توانند اندازه های مختلفی داشته باشند.

در ستون های مویی مقدار کم نمونه لازم است و بعضی مواقع این مقدار نمونه آنقدر کم است که میکرو سرنگ های معمول قادر به تزریق آن مقادیر نخواهد بود. در این حالت از سیستم تقسیم کننده نمونه (split injector) استفاده می شود که فقط بخش کوچکی از نمونه تزریق شده وارد ستون شود. سرعت جریان و دمای تزریق از موارد مهم در سیستم های تزریقی است.

ستون ها و آون

ستون مهم ترین قسمت دستگاه های کروماتوگرافی ست که نقش اصلی جداسازی را بر عهده دارد. به طور کلی در GC دو نوع ستون به کار می رود. ستون های پرشده یا فشرده (packed column) و ستون های مویی (capillary column).

ستون های پرشده اولین نوع ستون های مورد استفاده بوده و از جنس لوله های فلزی یا شیشه ای هستند که با ذرات جامد کاملا پر می شوند. ستون های از جنس فولاد بسیار مقاوم هستند ولی باید توسط کارخانه سازنده پر شوند. ستون های مسی انعطاف پذیر بوده،  به راحتی پر می شوند و به شکل مارپیچ درآیند ولی به علت تشکیل اکسید مس در جداره ستون امکان کاتالیز برخی واکنش ها وجود دارد. ستون های شیشه ای اگرچه شکننده هستند ولی به علت شفاف بودن، تشخیص حباب های هوا در ستون امکان پذیر است. ستون های پرشده معمولا بین 2 تا 3 متر طول و 2-4 میلی مترقطر داخلی هستند. ماده پرکننده باید ذرات کروی یکنواخت با قدرت مکانیکی خوب، سطح ویژه مناسب و بی اثر در دماهای بالا باشد.

ستون های مویی به شکل لوله های باز از جنس شیشه های کوارتزی یا فلزی هستند که فاز ساکن به صورت یک لایه فیلم نازک روی دیواره داخلی  ستون قرار گرفته است. این ستون ها به دو دسته کلی تقسیم می شوند:

لوله ای باز دیوار اندود (Wall coated open tubular, WCOT)

سطح داخلی ستون با لایه بسیار نازکی از فاز ساکن پوشانده شده است. از متداول ترین نوع WCOT ستون های لوله باز سیلیس جوش خورده (Fused silica open tubular, FSOT) است که از سیلیس حاوی مقادیر کم اکسدهای فلزی  ساخته شده و با پوشش پلی ایمیدی کاملا انعطاف پذیر بوده و می توان آنها را به صورت مارپیچ یا حلقه در آورد.

لوله ای باز تکیه گاه اندود (Support coated open tubular, SCOT)

در این نوع ستون سطح درونی لوله بالایه نازکی از مواد نگهدارنده مانند خاک دیاتومه  (به ضخامت تقریبی 30 میکرومتر) پوشانده می شود و سپس فاز ساکن بر روی آن قرار داده می شود.  ستون های SCOT ظرفیت پذیرش مقدار بیشتری از نمونه را دارد زیرا به دلیل ضخامت فاز ساکن دیرتر از ستون های WCOT اشباع می شوند.

طول ستون های مویی از 15 تا 50 متر و قطر داخلی آنها از 0.15 تا 0.55 میکرومتر متغیر است.

انتخاب ماده مناسب به عنوان فاز ساکن برای یک جداسازی خوب و کارایی مناسب بسیار با اهمیت است. فاز ساکن باید از نظر شیمیایی بی اثر بوده و پایداری حرارتی خوبی داشته باشد.  برای فازهای ساکن مایع باید فراریت کمی نیز داشته باشند به طوری که نقطه جوش مایع حداقل 100 درجه سانتی گراد بالاتر از ماکزیمم دمای عملی ستون باشد. متداول ترین فازهای ساکن مورد استفاده برای ستون های پرشده از خاك طبيعي یا دياتومه تهیه می شوند. فازهای ساکن متداول معمولا از جنس پلی سیلوکسان ها یا پلی اتیلن گلیکول هستند که پایداری حرارتی تا 350 درجه سانتی گراد را دارند. فازهای ساکن بر حسب پیوند شیمیایی به دو دسته کلی قطبی و غیر قطبی تقسیم می شوند.

دمای ستون پارامتر بسیار با اهمیتی ست که باید با دقت چند دهم سانتی گراد برای کارهای دقیق کنترل شود. بنابراین ستون باید در یک سیستم پایش دما یا آون قرار داده شود. دماي ستون بايد چند درجه بالاتر از نقطه جوش دير جوش ترين جزء موجود در نمونه باشد.  کنترل دمایی به دو صورت ایزوترمال (isothermal) یا تک دما و گرادیانی یا برنامه ریزی شده (programming) انجام می شود.

در روش ایزوترمال در طول آنالیز دما ثابت بوده و تغییر نمی کند و بيشتر زماني استفاده مي شود كه در نمونه فقط يك ماده مورد شناسايي وجود دارد يا اگر چند ماده وجود دارد، نقطه جوش آنها نزديك به هم است. در کنترل دمایی برنامه ریزی شده دمای ستون به طور پیوسته یا مرحله ای در طول آنالیز تغییر می کند و در مواقعي استفاده مي شود كه اجزاء موجود در نمونه گستره وسيعي از نقطه جوش دارند.

آشكارساز

شناسایی تمامی اجزاء شیمیایی نمونه ای که به ستون تزریق شده و یا یک گروه یا جزء ویژه از نمونه، وظیفه اصلی آشکارساز در GC است. در واقع آشکارساز با حضور اجزاء موجود در گاز حاملی که به آشکارساز می رسد، پاسخ الکتریکی می دهد. اگر آشکارسازی بتواند به تمام انواع نمونه های موجود پاسخ قوی دهد یک آشکارساز عمومی (universal) و اگر فقط به گروه یا ترکیبات ویژه ای واکنش نشان دهد، یک آشکارساز انتخابی ست.

یک آشکارساز ایده آل در GC باید حساسیت مناسب داشته، پایدار باشد، و از دقت، صحت و تکرارپذیری مناسبی برخوردار باشد. ضمنا باید زمان پاسخ مناسبی داشته باشد که با سرعت عبور اجزا با گازحامل از آشکارساز بتواند واکنش نشان دهد. حد تشخیص (detection limit) و گستره خطی (linearity range) آشکارساز برای آنالیزهای کمی بسیار اهمیت دارد.

آشکارساز یونش شعله ای (Flame ionization detector, FID)

آشکارساز یونش شعله ای یا FID متداول ترین آشکارساز مورد استفاده در GC است که از یک شعله هوا/هیدروژن برای پیرولیز ترکیبات آلی و یک جمع کننده (collector) برای جمع آوری یون ها و الکترون های تولید شده از فرایند پیرولیز تشکیل شده است. جریان الکتریکی حاصل از یونیزه شدن اتم های کربن با یک امپلی فایر تقویت می شود. پاسخ آشکارساز به نسبت هوا/هیدروژن و گاز حامل وابسته است. حساسيت و گستره خطی بالا، نویز پایین و سهولت استفاده از مزایای این آشکارساز است.

ترکیبات آلی حاوی گروه هاي عاملي مانند كربونيل، الكل، هالوژن و آمين، يون هاي بسيار كمي توليد مي كنند و يا اصلا توليد نمي كنند. و هم چنین به گازهای احتراق ناپذیرشامل SO₂, NO_x ،CO₂  وH₂O حساس نیست و برای ترکیبات غیرآلی نیز پاسخی ندارد. چون این آشکارساز به آب و اکسیدهای نیتروژن و گوگرد حساس نیست تجزیه نمونه های آلی شامل این ترکیبات بسیار مفید است.

آشکارساز گرما رسانندگی (Thermal Conductivity Detector, TCD )

آشکارساز گرما رسانندگی یا TCD یک آشکارساز عمومی ست که برای شناسایی هم ترکیبات آلی و هم معدنی به کار می رود. اساس آن تغییرپذیری هدایت گرمایی یک گاز است که به وسیله تغییر مقاومت فلزی واقع در یک محفظه گرمایش سنجیده می شود.

این آشکار ساز دارای دو محفظه گرمایشی کاملا مشابه هستند که هرکدام یک فیلامان از جنس تنگستن، طلا یا پلاتین هستند که به طور الکتریکی گرم می شوند. گاز حامل خالص از یک محفظه و گاز خارج شده از ستون حاوی نمونه از محفظه دیگر عبور می کنند. حضور مقادیر کم نمونه سبب تغییر هدایت پذیری شده و در نتیجه فیلامان نمونه داغتر ار فیلامان گازحامل می شود و این باعث اختلاف مقاومت و اختلاف جریان بین دو فیلامان می شود. آشکارساز میزان اختلاف جریان بین دو محفظه را ثبت نموده به صورت پیک نشان می دهد. هیدروژن و هلیم تا ده بار هدایت پذیری بیشتری از ترکیبات آلی دارند.

گازهای هلیم و هیدروژن بیشترین اختلاف را ایجاد می کنند و بنابراین حساسیت بیستری دارند. گاز نیتروژن تفاوت کمی در هدایت گرمایی ایجاد می کند بنابراین برای استفاده با این آشکارساز چندان مناسب نیست. از مزایای این آشکارساز عدم تخریب نمونه و پاسخ به تمامی ترکیبات آلی و معدنی ست. در مقایسه با آشکارساز های دیگرحساسیت بالایی ندارند.

آشکارساز الکترون گیرانداز  (Electron capture detector, ECD)

در آشکارساز الکترون گیرانداز  یا ECD نمونه خروجی از ستون وارد یک سل شیشه ای می شود که اتم های رادیو اکتیو نشر کننده β مانند ⁶³Ni دوپه شده است. الکترون نشر شده از اتم های رادیواکتیو سبب یونیزاسیون گاز حامل شده و در غیاب گونه های آلی یک جریان ثابتی از الکترون ایجاد می شود. در حضور گونه های گیرنده الکترون، این جریان ثابت کاهش می یابد. کاهش جریان متناسب با غلظت گونه های گیرنده الکترون است. از هلیم و هیدروژن به عنوان گاز حامل نمی توان استفاده کرد چون یونیزه نمی شوند. این آشکارساز بسیار گزینش پذیر است و به مولکول های دارای گروه های الکترونگاتیو مانند هالوژن ها، کینون ها، گروه های نیترو و پراکسیدها حساس است اما پاسخی برای گرو های الکل، آمین و هیدروکربنی ندارد. ECD یک آشکارساز مهم و متداول در آنالیز و اندازه گیری حشره کش های کلردار است. از عیوب این آشکارساز گستره خطی کم آن است.

سه آشکارساز FID, TCD و ECD متداول ترین آشکارسازهای مورد استفاده در GC هستند. برحسب موارد خاص آشکارسازهای گزینش پذیر بسیاری معرفی و ساخته شده اند.

آشکارساز طیف سنج جرمی (Mass Spectrometry detectors):

آشکارساز طیف سنج جرمی یکی از قوی ترین آشکارسازهای مورد استفاده در GC است که تلفیقی از روش GC و طیف سنج جرمی است. استفاده از نام اختصاری GC-MS در سال های اخیر متداول تر شده است. در طیف سنج جرمی جداسازی یون ها بر اساس نسبت جرم به بار (m/z) آنها و تحت تاثیر میدان های الکتریکی و مغناطیسی صورت می گیرد. در واقع اجزای نمونه پس از جداسازی در ستون کروماتوگرافی و حذف گاز حامل، وارد محفظه یونش طیف سنج جرمی می شوند و با استفاده از میدان های الکتریکی و مغناطیسی شناسایی کمی و کیفی اجزاء نمونه براساس m/z صورت می گیرد. در كروماتوگرافي گازي- طيف سنج جرمي (GC-MS)، خروجی ستون GC وارد طیف سنج جرمی می شود. بنابراین GC-MS فقط قادر به شناسایی و اندازه گیری ترکیباتی ست که بتوان به GC تزریق کرد یعنی ترکیبات فرار یا ترکیباتی که با مشتق سازی یا حلال های خاص امکان فرار بودن پیدا می کنند.

امروزه دستگاه GC را می توان با دو طیف سنج جرمی متوالی (tandem) تلفیق کرد که این روش تلفیقی GC-MS/MS تکنیک بسیار قوی برای شناسایی اجزاء یک مخلوط است.

آنالیز کمی و کیفی با کروماتوگرافی گازی

جهت شناسايي کیفی مواد با GC از زمان بازداریt_R  استفاده مي شود. زمان بازداری زماني است كه طول مي كشد تا جسم ازآشکارساز خارج شود، يعني از زمان تزريق نمونه تا زمان ظاهرشدن پيك ها روي دستگاه كه براي هر جزئی در نمونه تحت شرايط ثابت، مقداري ثابت است. از مقايسه زمان بازداری  نمونه یا جزء معلوم با زمان بازداری  نمونه مجهول، مي توان اجزاي موجود در نمونه مجهول را تشخيص داد. شاخص بازداری کواتس (kovats retention index) نیز یک برای شناسایی ترکیبات مجهول به خصوص الکان ها کاربرد ویژه ای دارد. در واقع کتابخانه های از شاخص های بازداری مواد ایجاد شده اند که با داشتن شاخص بازداری ترکیب مجهول، امکان شناسایی آن فراهم می شود.

اندازه گیری کمی معمولا بر اساس سطح زیر منحنی (Area under curve, AUC) هر پیک انجام می شود. با رسم سطح زیر پیک نمونه های استاندارد برحسب غلظت آنها، و مقایسه سطح یر پیک  نمونه مجهول غلظت آن تخمین زده می شود.

نکات

– جداسازی و آنالیز ترکیبات فرار و ترکیباتی که امکان تبدیل شدن به گاز بدون تجزیه شدن را دارند.

–  سريع و ساده

– قابلیت اندازه گیری کمی و شناسایی کیفی

– ترکیباتی که نقاط جوش نزدیک به هم دارند و جداسازی آنها به روش تقطیر مقدور نیست توسط GC قابلیت جداسازی و اندازه گیری را دارند.

– امکان جداسازی ترکیبات پیچیده در حداقل زمان

 کاربرد کروماتوگرافی گازی

فارماکولوژی: آنالیز مواد باقیمانده و حلال ها در محصولات میانی و نهایی، سنجش داروها، اندازه گیری ناخالصی ها و مواد فرار

كشاورزی و صنایع غذایی: آنالیز باقیمانده سموم ، حشره کش ها، قارچ کش ها و .. ، آنالیز عطر و اسانس، تشخیص تقلب مواد عذایی (Food adulteration) ، پروفایل اسیدهای چرب و ..

محیط زیست: آنالیز ترکیبات فرار در منابع آبی و پساب ها، آنالیز هوا و مانیتورینگ آلاینده های اتمسفری، باقیمانده سموم و…

پتروشیمی: آنالیز گازهای پالایشگاه، میعانات گازی و …

صنایع آرایشی بهداشتی